8分鐘前 江蘇PCR實驗室服務為先「英瀚斯」[英瀚斯2eefa30]內容：

基因組甲l基化水平(Methyl ati on Content)的分析:

1.高l效液相色譜(Hi gh-performanceLi qui dChromatography, HPLC)HPLC是- -種比較傳統的方法,是根據DNA或蛋白分子量和構象的不同而使其加以分離。由于在動態相和靜態相下分子的光吸收度并不相同而加以定量。隨著系統的壓強的增加，其分辨率增l高。故而能夠定量測定基因組整體水平DNA甲l基化水平。C使用Imageproplus軟件對A蛋白灰度檢測，A蛋白表達變化統計圖。該方法由Ruo等1980年首l次報道。過程是將DNA樣品先經鹽酸或氫l氟酸水解成堿基，水解產物通過色譜柱，結果與標準品比較，用紫外光測定吸收峰值及其量，計算5 mC/(5mC+5C)的積分面積就得到基因組整體的甲l基化水平。這是一種檢測DNA甲l基化水平的標準方法。

2.高l效毛細管電泳法(Hi gh-per formance Capillary Electrophoresis, HPCE)這是一-種利用窄孔熔融石英毛細管來從復合物中分離不同化學組分的技術。其基礎是在強電場下不同分子的由于其所帶電荷，大小，結構以及疏水性等不同而相互分開。ELISA是一種結合抗原、抗ti特異性反應和酶對底物高xiao催化作用的高敏感性免yi學實驗技術。用HIPCE方法處理DNA水解產物來確定5mC水平，簡便，經濟且敏感性高。

凝膠阻滯遷移電泳檢測服務（EMSA）

凝膠遷移或電泳遷移率實驗（electrophoretic mobility shift assay，EMSA）是一種研究DNA/RNA結合蛋白和其相關的DNA/RNA結合序列相互作用的技術，可用于定性和定量分析。依據實驗需要，設計標記探針、非標記探針、蛋白特異性抗ti等參照物，基于DNA-蛋白質或RNA-蛋白質復合體在聚bing烯酰胺凝膠電泳（PAGE）中有不同遷移率的原理，當轉錄因子與特異的DNA或RNA結合后，其在PAGE中的遷移率將小于未結合核蛋白轉錄因子的DNA，從而檢測到活化的與DNA或RNA結合的蛋白轉錄或調節因子。microRNA芯片:RNA干擾(RNAInterference,RNAi)現象是一種進化上保守的抵御轉基因或外來病毒qin犯的防御機制。

二、操作步驟：

1. 所有在純化系統里使用的溶液當日都需要經過 0.22μm 的濾膜抽濾、脫氣處理；保存 4℃ 冰箱里的緩沖液若要在室溫使用需恢復至室溫后抽濾脫氣；

2. 樣品上柱純化前，需先濾膜過濾，少量樣品可用離心（13000rpm，10min）；

3. 依次用水、緩沖液洗泵；設置流速和柱前警報壓（壓力值參閱層析柱及填料說明書，取較小的一個大耐受壓力）。防止柱中進入氣泡，影響分離效果；

4. 當柱子限壓在 0.3MPa，或者在限壓狀態下流速很低時，pH valve 中的 Restirtor 可以切換成 Off line，即顯示 By-pass 狀態；

5. 當需要通過儀器上樣環上樣時，將 W1 閥口處換成帶透明短軟管的閥門，從此處閥門位通過倒吸樣品上樣；

6. 進樣閥「Inject」為上樣狀態。上樣結束可將進樣閥切換回「Load」狀態。并用純水認真清洗上樣環至少 3 次；將 W1 閥口處換回原來接頭閥門。

7. 純化結束后，用純水清洗泵和平衡柱子；再用 20% 的乙醇清洗泵以及系統。長期不用，層析柱應保存在 20% 的乙醇中，泵放置在 20% 乙醇中；

8. 實驗結束后及時傾倒廢液瓶里的廢液；

20.Primer設計的基本原則是什么？

答：引物設計的下列原則供您參考。

◆引物長度一般在18-35mer。

◆G-C含量控制在40-60%左右。

◆避免近3'端有酶切位點或發夾結構。

◆如果可能避免在3'端5個堿基有2個以上的G或C。

◆如果可能避免在3'端1個堿基為A。

◆避免連續相同堿基的出現，特別是要避免GGGG或更多G出現。

◆退火溫度Tm控制在 58-60C 左右。

◆如果是設計點突變引物，突變點應盡可能在引物的中間。

21.為什么引物的OD260/OD280小于1.5 ？

答：引物應該全是DNA，但是OD260/OD280的比值為什么那么低，怎么會有蛋白質污染？引物化學合成，哪里有機會污染到蛋白質？需要指出的是OD260/OD280的比值不能用來衡量引物的純度。OD260/OD280的比值過低一般是由于引物中C/T 的含量比較高所致。下表是一個20mer 同聚體引物的OD260/OD280的比值，清楚表明OD260/OD280的比值與引物的堿基組成密切相關。隨后設計BSP引物進行PCR，在擴增過程中尿嘧定全部轉化為胸腺嘧定，zui后對PCR產物進行測序就可以判斷CpG位點是否發生jia基化，稱為BSP-直接測序法。