同一樣本可以多次做原位雜交實(shí)驗(yàn)嗎?

一般情況下，如果操作沒(méi)有得到理想的結(jié)果，是可以將探針洗滌然后進(jìn)行再次的雜交的。如果使用的是直標(biāo)型探針，還可以使用不同探針對(duì)同一樣本進(jìn)行反復(fù)雜交。針對(duì)不同的樣本，處理方法略有不同。

原位雜交實(shí)操中哪些因素比較重要?

重要的因素：溫度、光照、濕度和試劑的PH值。溫度和濕度直接影響著探針和目標(biāo)DNA的雜交效率；光照影響著熒光染料的強(qiáng)度，所以探針要避光保存，其已經(jīng)雜交的片子可用防熒光淬火劑封片且避光保存；各種試劑pH也要達(dá)到要求，這也直接關(guān)系到原位雜交的穩(wěn)定性。

一. 原位雜交天

1. 重新水化和固定

1） 吸取固定好的胚胎，加入50%的PBST溶液，放置5分鐘。

2） 置換成30％的PBST溶液，放置5分鐘

3） 置換成PBST溶液，放置5分鐘，重復(fù)一次

4） 置換成4％多聚甲醛的PBS溶液固定20分鐘

5） 用PBST洗兩次，每次放置五分鐘，室溫。

蛋白酶處理與后固定（本實(shí)驗(yàn)不做此步）

1） 用10ul/ml的蛋白酶K在室溫下處理胚胎。5體節(jié)以下的胚胎不處理，5體節(jié)到24小時(shí)的胚胎處理3分鐘，24小時(shí)以上的胚胎處理5分鐘或者更長(zhǎng)。發(fā)育時(shí)間越短的胚胎越嫩，可以不用或者少用蛋白酶處理，發(fā)育時(shí)間長(zhǎng)的胚胎就需要用蛋白酶來(lái)疏松組織，以便于雜交。

2） 用PBST溶液輕洗，在PBST中放置5分鐘。

3） 用4％多聚甲醛的PBS溶液固定20分鐘，室溫。

4） 用PBST洗兩次，每次放置五分鐘，室溫。

原位雜交第二天

1.

1）將探針回收，放于－20C保存(通常探針可重復(fù)使用十次左右)。

2）加入50%甲酰胺/2XSSCT溶液1毫升，60℃，放置30分鐘，重復(fù)一次。

3）置換2XSSCT1ml，60℃，放置15分鐘。

4）置換0.2XSSCT1ml，60℃，放置30分鐘，重復(fù)一次。

2.

1）用MABT洗兩次，每次五分鐘，放在搖床輕輕搖動(dòng)。

2）室溫下加1ml 1：2：7溶液，時(shí)間為一小時(shí)。

3）按1：3000的比例在1：2：7溶液中加入酶連，4C 冰箱過(guò)夜。

植物染色體原位雜交是一種重要的分子生物學(xué)技術(shù)，它可以用來(lái)研究植物基因組的結(jié)構(gòu)和功能。該技術(shù)利用DNA探針與目標(biāo)DNA序列的互補(bǔ)性結(jié)合，通過(guò)熒光或性標(biāo)記來(lái)檢測(cè)目標(biāo)DNA序列在染色體上的位置和數(shù)量。

植物染色體原位雜交技術(shù)的基本原理是將DNA探針標(biāo)記上熒光或性同位素，然后將其與目標(biāo)DNA序列進(jìn)行雜交。在雜交過(guò)程中，探針與目標(biāo)DNA序列互補(bǔ)結(jié)合，形成穩(wěn)定的雙鏈DNA分子。隨后，通過(guò)熒光或性同位素探測(cè)技術(shù)，可以檢測(cè)到目標(biāo)DNA序列在染色體上的位置和數(shù)量。