分子實驗介紹——熒光定量PCR檢測
熒光定量PCR是檢測生物樣品中RNA含量的普遍的方法，通過熒光染料或熒光標記的特異性的探針，對PCR產(chǎn)物進行標記跟蹤，實時在線監(jiān)控反應(yīng)過程，結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對產(chǎn)物進行分析，計算待測樣品模板的初始濃度。目前主要使用Sybr green和taqman法對RNA含量進行檢測。這些方法究竟孰優(yōu)孰劣，斯坦福大學(xué)醫(yī)學(xué)院遺傳學(xué)系的研究人員對市場上三個主流的外顯子組測序平臺進行了比較。Sybr green在低樣本量時成本較低，目前選用的較多。
SYBR Green I是一種只與DNA雙鏈結(jié)合的熒光染料。當它與DNA雙鏈結(jié)合時，發(fā)出熒光；從DNA雙鏈上釋放出來時，熒光信號急劇減弱。因此，在一個體系內(nèi)，其信號強度代表了雙鏈DNA分子的數(shù)量。SYBR Green熒光染料法定量PCR的基本過程是：1、開始反應(yīng)，當SYBR Green染料與DNA雙鏈結(jié)合時發(fā)出熒光。2、DNA變性時，SYBR Green染料釋放出來，熒光急劇減少。分子生物學(xué)檢測技術(shù)是現(xiàn)代分子生物學(xué)與分子遺傳學(xué)取得進步的結(jié)晶，是在人們對基因的結(jié)構(gòu)以及基因的表達和調(diào)控等生命本質(zhì)問題的認識日益加深的基礎(chǔ)上產(chǎn)生的。3、在聚合延伸過程中，引物退火并形成PCR產(chǎn)物。4、聚合完成后，SYBR Green染料與雙鏈產(chǎn)物結(jié)合，定量PCR系統(tǒng)檢測到熒光的凈增量加大。
實驗流程：細胞或組織RNA提取-RNA濃度檢測-RNA逆轉(zhuǎn)錄-定量PCR檢測。
結(jié)果示例：
圖 A 基因擴增曲線圖；B 基因擴增溶解曲線圖；C mRNA相對表達量變化
從圖中可以擴增曲線可以看出目的RNA擴增效果，溶解曲線可以看出引物識別特異性情況，通過使用ΔΔCt方法計算可以得到每個組中目的mRNA表達變化。
逆轉(zhuǎn)錄病毒構(gòu)建及包裝
逆轉(zhuǎn)錄病毒（Retrovirus）是一類RNA病毒。在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以病毒RNA為模板合成cDNA再通過DNA、轉(zhuǎn)錄、翻譯等過程形成病毒顆粒。逆轉(zhuǎn)錄病毒表達系統(tǒng)是一種新的重組蛋白表達系統(tǒng)，由逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、輔助載體（表達病毒包裝需要的蛋白質(zhì)）和包裝細胞系組成。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在外源基因表達、基因沉默、、生物制藥等得到廣泛的應(yīng)用。外顯子測序外顯子組測序（exome-seq）是對定向富集的基因組DNA進行高通量測序，它能夠以相對低的費用對人類外顯子組進行拷問。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體主要優(yōu)點：轉(zhuǎn)染范圍廣，可以各種細胞類型，轉(zhuǎn)入的外源基因可完全融合，對細胞率高，細胞不產(chǎn)生病變，可建立細胞系長期持續(xù)表達外源基因。
逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)共有兩部分組成：包裝細胞系和缺陷病毒本身。在逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中，去除了正常的蛋白編碼序列而保留了和包裝信號，通過分子技術(shù)將目的基因插入此載體上，而包裝細胞系能提供病毒載體包裝成病毒粒子所需的結(jié)構(gòu)蛋白。當重組病毒載體導(dǎo)入包裝細胞后，缺陷病毒載體和包裝細胞的互補作用共同完成病毒裝配，該病毒顆粒可其它宿主細胞，此時目的基因進入該細胞并整合到細胞基因組中，導(dǎo)致插入序列在宿主細胞中表達，產(chǎn)生目的蛋白。將含有靶基因mRNA同源互補序列的RNA（DoublestrandRNA，dsRNA）導(dǎo)入細胞后，能夠特異地識別該mRNA，引起mRNA的降解，從而導(dǎo)致相應(yīng)的功能缺失。宿主細胞不能像包裝細胞那樣為缺失結(jié)構(gòu)基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒提供結(jié)構(gòu)蛋白，因而在宿主細胞內(nèi)不會產(chǎn)生新的毒顆粒，保證了該載體在生物制品領(lǐng)域的生物安全性問題。
凝膠阻滯遷移電泳檢測服務(wù)（EMSA）
凝膠遷移或電泳遷移率實驗（electrophoretic mobility shift assay，EMSA）是一種研究DNA/RNA結(jié)合蛋白和其相關(guān)的DNA/RNA結(jié)合序列相互作用的技術(shù)，可用于定性和定量分析。依據(jù)實驗需要，設(shè)計標記探針、非標記探針、蛋白特異性抗ti等參照物，基于DNA-蛋白質(zhì)或RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體在聚bing烯酰胺凝膠電泳（PAGE）中有不同遷移率的原理，當轉(zhuǎn)錄因子與特異的DNA或RNA結(jié)合后，其在PAGE中的遷移率將小于未結(jié)合核蛋白轉(zhuǎn)錄因子的DNA，從而檢測到活化的與DNA或RNA結(jié)合的蛋白轉(zhuǎn)錄或調(diào)節(jié)因子。以zui小點面積30，平滑度2為主要參數(shù)zui大限度檢測蛋白質(zhì)點。