轉(zhuǎn)錄組重測(cè)序
轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的研究對(duì)象為特定細(xì)胞在某一功能狀態(tài)下所能轉(zhuǎn)錄出來的所有mRNA的總和。轉(zhuǎn)錄組研究是基因功能及基因結(jié)構(gòu)等研究的基礎(chǔ)，通過新一代高通量測(cè)序，能夠快速的獲得某一物種特定組織或在某一狀態(tài)下的幾乎所有轉(zhuǎn)錄本序列信息，已廣泛應(yīng)用于臨床診斷、基礎(chǔ)研究和研發(fā)等領(lǐng)域。將含有靶基因mRNA同源互補(bǔ)序列的RNA（DoublestrandRNA，dsRNA）導(dǎo)入細(xì)胞后，能夠特異地識(shí)別該mRNA，引起mRNA的降解，從而導(dǎo)致相應(yīng)的功能缺失。
轉(zhuǎn)錄組Resequencing針對(duì)的是有參考基因組的物種。用新一代高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)某物種的特定組織或細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，與參考基因組比較，可以得到基因表達(dá)差異、可變剪接、融合基因等遺傳調(diào)控信息。
分子與質(zhì)粒載體構(gòu)建
實(shí)驗(yàn)原理
外源DNA與載體分子的連接就是DNA重組，這樣重新組合的DNA叫做重組體或重組子。重組的DNA分子是在DNA連接酶的作用下,有Mg2+、ATP存在的連接緩沖系統(tǒng)中，將分別經(jīng)酶切的載體分子與外源DNA分子進(jìn)行連接。DNA連接酶有兩種：T4噬菌體DNA連接酶和大腸DNA連接酶。兩種DNA連接酶都有將兩個(gè)帶有相同粘性末端的DNA分子連在一起的功能，而且T4噬菌體DNA連接酶還有—種大腸連接酶沒有的特性，即能使兩個(gè)平末端的雙鏈DNA分子連接起來。隨后設(shè)計(jì)BSP引物進(jìn)行PCR，在擴(kuò)增過程中尿嘧定全部轉(zhuǎn)化為胸腺嘧定，zui后對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序就可以判斷CpG位點(diǎn)是否發(fā)生jia基化，稱為BSP-直接測(cè)序法。但這種連接的效率比粘性末端的連接效率低，一般可通過提高T4噬菌體DNA連接酶濃度或增加DNA濃度來提高平末端的連接效率。
T4噬菌體DNA連接酶催化DNA連接反應(yīng)分為3步：，T4DNA連接酶與輔助因子ATP形成酶—AMP復(fù)合物；然后，酶—AMP復(fù)合物再結(jié)合到具有5’磷酸基和3’羥基切口的DNA上，使DNA腺苷化；后產(chǎn)生一個(gè)新的磷酸二酯鍵，把切口封起來。
DNA重組的方法主要有粘端連接法和平端連接法，為了防止載體本身的自連，可以通過(牛堿性磷酸酶)CIP處理克服。
連接反應(yīng)的溫度在37℃時(shí)有利于連接酶的活性.但是在這個(gè)溫度下，粘性末端的氫鍵結(jié)合是不穩(wěn)定的。因此人們找到了一個(gè)折中溫度，即12-16℃，連接12-16h(過夜)，這樣既可大限度地發(fā)揮連接酶的活性，又兼顧到短暫配對(duì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。
5.長(zhǎng)可以合成多長(zhǎng)的引物？
答：引物越長(zhǎng)，出現(xiàn)問題的概率就越大。有的公司合成過120base的引物，產(chǎn)率很低。除非需要，建議合成片段長(zhǎng)度不要超過80mer，按照目前的引物合成效率，80mer的粗產(chǎn)品，全長(zhǎng)（還不一定正確）引物的百分比不會(huì)超過40%，后續(xù)處理還有丟失很多，的產(chǎn)量很低。PCR的電泳檢測(cè):如在反應(yīng)管中加有石蠟油,需用100ul進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液,以除去石蠟油。
6.需要合成多少OD數(shù)？
答：根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康拇_定。一般PCR擴(kuò)增，2 OD引物，可以做200-500次50ul標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)。如果是做基因拼接或退火后做連接，1 OD就足夠了。但是有些研究人員，就做幾次PCR，但是卻要5-10 OD。做全基因構(gòu)建的引物都比較長(zhǎng)，但是我們有些研究人員也要求高OD數(shù)。從單個(gè)的生物體到qi官到組織到細(xì)胞，再?gòu)募?xì)胞結(jié)構(gòu)到核酸和蛋白的分子水平，人們意識(shí)到可以通過檢測(cè)分子水平的線性結(jié)構(gòu)（如核酸序列），來橫向比較不同物種，同物種不同個(gè)體，同個(gè)體不同細(xì)胞或不同生理（病理）狀態(tài)的差異。片段越長(zhǎng), 全長(zhǎng)得率就越低，出錯(cuò)的幾率就越大。超出需要之外的OD數(shù)要求，其實(shí)也是對(duì)社會(huì)資源的一種浪費(fèi)，同時(shí)也從一個(gè)側(cè)面反映了部分研究人員特別是新手的自信心不足，總覺得需要重復(fù)多次才能成功。
16.長(zhǎng)鏈引物為什么出錯(cuò)的幾率非常高？
答：引物合成時(shí)，每一步反應(yīng)效率都不能達(dá)到，產(chǎn)生堿基插入、缺失、置換突變的因素客觀條件都有一直存在。引物鏈越長(zhǎng)，突變的頻率累加起來就越高。研究人員總希望合成的引物萬無一失，這種心情可以理解。但是猶如PCR擴(kuò)增，不可能保證擴(kuò)增產(chǎn)物中沒有突變，引物合成也不可能保證正確。要知道，引物合成中發(fā)生錯(cuò)誤（非人為因素）的頻率，比任何高保真高溫聚合酶PCR擴(kuò)增過程所產(chǎn)生的頻率都要高。線粒體的組成可以從兩個(gè)層面上反映物種及群體的遺傳和進(jìn)化，即核酸序列組成和基因組的結(jié)構(gòu)特征，兩者的特征具有不同的進(jìn)化機(jī)制和進(jìn)化速度，在進(jìn)化生物學(xué)研究中可以很好的互補(bǔ)。做引物合成，長(zhǎng)鏈引物合成，您要有引物中部分引物可能有突變的思想準(zhǔn)備。
17.如果測(cè)序發(fā)現(xiàn)突變，該如何處理？
答：遇到這種情況，首先和核酸合成廠家取得聯(lián)系，生產(chǎn)人員會(huì)檢查生產(chǎn)的原始記錄，主要是核對(duì)合成序列是否和定單一致，他們?cè)陔娔X中一般會(huì)保留所有原始數(shù)據(jù)。在確認(rèn)引物合成序列沒有輸錯(cuò)的情況下，建議重新挑取測(cè)序，可能會(huì)找到正確的。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，40個(gè)堿基以下的引物，測(cè)1-2個(gè)就可以了；40個(gè)以上的特別是用于全片段拼接合成的，就需要多測(cè)一些了。一般情況下，每個(gè)突變的位點(diǎn)都不一樣，提示正確的總是有的，就是如何找到它。也可以要求公司將引物免費(fèi)重合一次，不過重合的引物和次的引物一樣，都可能含突變，不會(huì)因?yàn)橹睾系囊锞蜏p少您的遇到問題的幾率。乳糖發(fā)酵試驗(yàn):樣品稀釋后，選擇三個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度接種三管乳糖膽鹽發(fā)酵管。基因拼接過程中，如果發(fā)現(xiàn)一段區(qū)域突變點(diǎn)不多，就多測(cè)幾個(gè)，否則就重合一下引物。