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考馬斯亮藍G-250法測定蛋白質含量的原理是什么

在酸性條件下，考馬斯亮蘭G-250染料與蛋白質疏水區結合，導致da吸收峰由465 nm 變為595 nm，同時顏色也由棕色變為藍色,該藍色化合物顏色的深淺與蛋白質濃度的高低成正比關系。將蛋白質樣品或稀釋的BSA 與Bradford試劑混合，測量在595 nm處的吸收值，在建立由一系列稀釋的BSA建立的標準曲線的情況下，蛋白質的濃度可以根據標準曲線而確定。

考馬斯亮藍G-250（Coomassie brilliant blue G-250）測定蛋白質含量屬于染料結合法的一種。在游離狀態下呈紅色，da光吸收在488nm；當它與蛋白質結合后變為青色，蛋白質-色素結合物在595nm波長下有da光吸收。其光吸收值與蛋白質含量成正比，因此可用于蛋白質的定量測定。蛋白質與考馬斯亮藍G-250結合在2min左右的時間內達到平衡，完成反應十分迅速；其結合物在室溫下1h內保持穩定。

該法是1976年Bradford建立，試劑配制簡單，操作簡便快捷，反應非常靈敏，靈敏度比Lowry法還高4倍，可測定微克級蛋白質含量，測定蛋白質濃度范圍為0～1 000μg/mL，xaio可測2.5μg/mL蛋白質，是一種常用的微量蛋白質快速測定方法。

考馬斯亮藍有G250和R250兩種。其中考馬斯亮藍G250由于與蛋白質的結合反應十分迅速，常用來作為蛋白質含量的測定。考馬斯亮藍R250與蛋白質反應雖然比較緩慢，但是可以被洗脫下去，所以可以用來對電泳條帶染色。

鑒別試驗

（1）本品的水溶液（1+2000），顯藍色。

（2）取本品的水溶液（1+1000）5ml，加鹽酸1ml時，變為暗黃綠色。

（3）本品的硫酸溶液（1+100）顯暗橙色，取此液2-3滴加水5ml時，顯綠色。

（4）本品的水溶液（1+1000）5ml，加（1+5）5ml，在水浴中加熱時變為紫紅色。

（5）取本品0.1g,加銨溶液（3+2000）200ml 溶解，取此溶液1ml，加銨溶液（3+2000）配至100ml的溶液，在波長628-632nm處有吸收帶。

純度試驗

（1）水不容物 小于0.20%。

（2）氯化物、硫酸鹽 以總量計，小于4.0%。

（3）重金屬 以Pb計，小于20ug/g。

（4 以As2O3計，小于4.0ug/g。

使用量：一般為0.025g/kg。

.使用方法：將準確稱量的本品置于容器中，逐漸加入適量溫水，并不斷攪拌使之完全溶解，所得溶液即可用于著色。

使用過程中應注意避免或減少酸、減、氧化計、還原計、金屬離子、微生物等物質的不良影響，并注意免受高溫與暴曬，以防褪色或變色。

復合著色劑的使用：根據需要，可將本品與本公司生產的其它色澤的著色劑按適當比例配置各種不同的顏色。