外顯子測(cè)序
外顯子組測(cè)序（exome-seq）是對(duì)定向富集的基因組DNA進(jìn)行高通量測(cè)序，它能夠以相對(duì)低的費(fèi)用對(duì)人類外顯子組進(jìn)行拷問。2009年，外顯子組捕獲工具的出現(xiàn)，讓外顯子組測(cè)序這種技術(shù)迅速紅起來(lái)。到目前為止，已有超過1萬(wàn)個(gè)外顯子組被測(cè)序。
如今有多家公司推出了外顯子組捕獲試劑，包括羅氏NimbleGen、安捷倫、Illumina，還有現(xiàn)在的華大基因。這些方法究竟孰優(yōu)孰劣，斯坦福大學(xué)醫(yī)學(xué)院遺傳學(xué)系的研究人員對(duì)市場(chǎng)上三個(gè)主流的外顯子組測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行了比較。該研究結(jié)果發(fā)表在《Nature Biotechnology》上。研究人員利用安捷倫、Illumina和NimbleGen的外顯子組測(cè)序平臺(tái)對(duì)同一個(gè)人類血液樣品進(jìn)行分析。他們的結(jié) 果表明，NimbleGen平臺(tái)作為一個(gè)使用高密度重疊探針的平臺(tái)，盡管覆蓋了較少的基因組區(qū)域，但在靈敏檢測(cè)小的變異時(shí)所需的測(cè)序量也少。在同樣獲得80M測(cè)序數(shù)據(jù)的情況下，NimbleGen有97%的目標(biāo)序列達(dá)到10x以上的測(cè)序深度，而其他產(chǎn)品只有90%。而安捷倫和Illumina的探針能夠在低密度下捕獲更多數(shù)量的變異。此外，Illumina還捕獲了未翻譯的區(qū)域，這是NimbleGen和安捷倫平臺(tái)無(wú)法靶定的。若miRNA與mRNA的結(jié)合位點(diǎn)不配對(duì)，則抑制mRNA的翻譯。研究人員還比較了同一樣品的外顯子組測(cè)序和全基因組測(cè)序（WGS），顯示外顯子組測(cè)序能夠檢測(cè)到WGS錯(cuò)過的小變異。
除了文中提到了三個(gè)主流平臺(tái)，外顯子組捕獲方面的新產(chǎn)品也在不斷推出，研究人員的選擇也將更廣泛。羅氏NimbleGen即將推出新一代的外顯子液相捕獲產(chǎn)品。這一新產(chǎn)品將可捕獲64M的基因組序列，包括外顯子以及miRNA，它含與其他NimbleGen液相捕獲產(chǎn)品相同的2.1M高密度探針，以高xiao、均一、特異、的定向捕獲。MiRNA是一類可以通過RNAi機(jī)制調(diào)節(jié)基因表達(dá)的內(nèi)源性小RNA，人工miRNA與shRNA的設(shè)計(jì)原理基本相同，由于miRNA具有內(nèi)源性，因此其更易產(chǎn)生有效的基因沉默。
二、使用說(shuō)明
1、裝載探針
對(duì)于刺激時(shí)間較短（通常為2小時(shí)以內(nèi)）的細(xì)胞，先裝載探針，后用活性氧陽(yáng)性對(duì)照及自己感興趣的刺激細(xì)胞。對(duì)于細(xì)胞刺激
時(shí)間較長(zhǎng)（通常為6小時(shí)以上）的細(xì)胞，先用活性氧陽(yáng)性對(duì)照及自己感興趣的刺激細(xì)胞，后裝載探針。
原位裝載探針：本方法僅適用于貼壁培養(yǎng)細(xì)胞。按照1：1000用無(wú)培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使終濃度為10微摩爾/升。去除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入適當(dāng)體積稀釋好的DCFH-DA。加入的體積以能充分蓋住細(xì)胞為宜，通常對(duì)于六孔板的一個(gè)孔加入稀釋好的DCFH-DA的體積為1毫升。37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20分鐘。分離培養(yǎng):將產(chǎn)氣發(fā)酵管培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種于伊紅美藍(lán)瓊脂平板上，36士1°C培養(yǎng)18-24h，觀察菌落形態(tài)。用無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞三次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。
16.長(zhǎng)鏈引物為什么出錯(cuò)的幾率非常高？
答：引物合成時(shí)，每一步反應(yīng)效率都不能達(dá)到，產(chǎn)生堿基插入、缺失、置換突變的因素客觀條件都有一直存在。引物鏈越長(zhǎng)，突變的頻率累加起來(lái)就越高。研究人員總希望合成的引物萬(wàn)無(wú)一失，這種心情可以理解。但是猶如PCR擴(kuò)增，不可能保證擴(kuò)增產(chǎn)物中沒有突變，引物合成也不可能保證正確。要知道，引物合成中發(fā)生錯(cuò)誤（非人為因素）的頻率，比任何高保真高溫聚合酶PCR擴(kuò)增過程所產(chǎn)生的頻率都要高。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在外源基因表達(dá)、基因沉默、、生物制藥等得到廣泛的應(yīng)用。做引物合成，長(zhǎng)鏈引物合成，您要有引物中部分引物可能有突變的思想準(zhǔn)備。
17.如果測(cè)序發(fā)現(xiàn)突變，該如何處理？
答：遇到這種情況，首先和核酸合成廠家取得聯(lián)系，生產(chǎn)人員會(huì)檢查生產(chǎn)的原始記錄，主要是核對(duì)合成序列是否和定單一致，他們?cè)陔娔X中一般會(huì)保留所有原始數(shù)據(jù)。在確認(rèn)引物合成序列沒有輸錯(cuò)的情況下，建議重新挑取測(cè)序，可能會(huì)找到正確的。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，40個(gè)堿基以下的引物，測(cè)1-2個(gè)就可以了；40個(gè)以上的特別是用于全片段拼接合成的，就需要多測(cè)一些了。一般情況下，每個(gè)突變的位點(diǎn)都不一樣，提示正確的總是有的，就是如何找到它。也可以要求公司將引物免費(fèi)重合一次，不過重合的引物和次的引物一樣，都可能含突變，不會(huì)因?yàn)橹睾系囊锞蜏p少您的遇到問題的幾率?；蚱唇舆^程中，如果發(fā)現(xiàn)一段區(qū)域突變點(diǎn)不多，就多測(cè)幾個(gè)，否則就重合一下引物。由于應(yīng)用各種性質(zhì)的微粒填料和加壓的液體流動(dòng)相，本法具有分離性能高，分析速度快的特點(diǎn)。